Establecimiento del esquema de purificación de los antígenos de SOBERANA®02, SOBERANA®Plus y SOBERANA 01 / Establishment of the purification scheme for SOBERANA®02, SOBERANA®Plus and SOBERANA 01 antigens

La urgente necesidad de desarrollar y producir vacunas seguras y efectivas para garantizar la reducción de la propagación del coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo, hizo que el Centro de Inmunología Molecular y el Instituto Finlay de Vacunas, desarrollaran dos vacunas y un candidato vacunal contra la COVID-19, que tienen como componente la molécula del dominio de unión al receptor (aa 319-541) del virus. Para establecer el proceso productivo, se realizaron experimentos en los posibles pasos del proceso de purificación de la molécula del dominio de unión al receptor (aa 319-541), con vistas a su posterior transferencia tecnológica a escala industrial. Dicha molécula está fusionada con una etiqueta de hexahistidina en su extremo C-terminal y presenta nueve residuos de cisteína en su secuencia que forman cuatro enlaces disulfuros intramoleculares, quedando una cisteína libre que permite obtener dos moléculas: dimérica y monomérica, antígenos que forman parte de las vacunas SOBERANA®02 y SOBERANA®Plus y el candidato vacunal SOBERANA 01. Se determinaron las mejores condiciones de adsorción de las matrices cromatográficas de afinidad por quelatos metálicos, intercambio catiónico y exclusión molecular. Se evaluó el desempeño del proceso a escala piloto y se caracterizó la molécula de acuerdo a sus propiedades físico-químicas y biológicas. Los resultados obtenidos mostraron un 60,02 ± 5,15por ciento de recuperación total de la proteína de interés, con más del 98% de pureza en ambas moléculas, una eficiente remoción de contaminantes y una antigenicidad mayor del 90por ciento referido al monómero control del dominio de unión al receptor con 99 por ciento de pureza, lo que demuestra que el proceso establecido es eficiente en la obtención de un producto con la calidad requerida(AU)

The urgent need to develop and produce safe and effective vaccines to guarantee the reduction of the spread of the type 2 coronavirus that causes severe acute respiratory syndrome, led the Center for Molecular Immunology and the Finlay Vaccine Institute to develop two vaccines and one candidate vaccine to combat the 2019 coronavirus pandemic. As part of the establishment of the production process, experiments were carried out on the possible steps of the purification process of the receptor binding domain molecule (aa 319-541) with a view to its subsequent technological transfer on an industrial scale. This molecule is fused with a hexahistidine tag at its C-terminal end and has nine cysteine residues in its sequence that form four intramolecular disulfide bonds; leaving a free cysteine that allows two molecules to be obtained: dimeric and monomeric, which constitute the antigens of the SOBERANA®02 and SOBERANA®Plus vaccines and the SOBERANA 01 vaccine candidate. The best adsorption conditions of the chromatographic matrices of affinity for metal chelates, cationic exchange and molecular exclusion were determined. The performance of the process was evaluated on a pilot scale and the molecule was characterized according to its physical-chemical and biological properties. The results obtained showed a 60.02 ± 5.15percent total recovery of the protein of interest with more than 98% purity in both molecules, an efficient removal of contaminants and an antigenicity greater than 90percent referred to the control monomer of the domain receptor binding with 99% purity; which demonstrates that the established process is efficient in obtaining a product with the required quality(AU)

Gestión de riesgos aplicado al diseño de un nuevo proceso productivo de un inmunoterapéutico del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología / Risk management applied to the design of a new production process for an immunotherapeutic from the Center for Genetic Engineering and Biotechnology

El estudio expone las acciones dirigidas a la reducción de los riesgos en el diseño de un nuevo proceso de producción del ingrediente farmacéutico activo de un inmunoterapéutico producido en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. El análisis modal de fallas y efectos fue conducido por un equipo multidisciplinario del referido centro. La administración de riesgos a la calidad se aplicó a la tecnología de obtención de una proteína recombinante con uso diagnóstico que se proponía transferir a la Dirección de Desarrollo Tecnológico. El riesgo en el diseño de un nuevo proceso de producción evaluó las fallas de mayor influencia en el bajo recobrado y el incumplimiento de las especificaciones de calidad del inmunoterapéutico. Las causas potenciales de estos fallas fueron: la insuficiente cantidad de viales de los bancos de células, el medio de cultivo complejo con componentes de origen bovino, la incorrecta manipulación de las muestras por los operarios, el uso de equipamiento no adecuado, los parámetros de operación (agitación, pH y conductividad) fuera de límites de especificación con efecto sobre la pureza por el alto porcentaje de contaminantes del hospedero; así como, un medio filtrante inadecuado unido a una incorrecta preparación del sistema de filtración redundantes en un producto no estéril. Las acciones llevaron a modificaciones en la tecnología propuesta por la Dirección de Investigaciones Biomédicas que permitió el diseño de un nuevo proceso productivo para un biofarmacéutico destinado al tratamiento de enfermedades virales crónicas(AU)

The study aimed at reducing risks in the design of a new production process for the active pharmaceutical ingredient of an immunotherapeutic produced at the Center for Genetic Engineering and Biotechnology. The failure mode and effects analysis were conducted by a multidisciplinary team from the center. Quality risk management was applied to the technology for obtaining a recombinant protein for diagnostic use that was proposed to be transferred to Technological Development Division. The risk analyses evaluated the greatest influence on low recovery and non-compliance with the immunotherapeutic quality specifications. The potential causes of the failures were: the insufficient number of vials in cell banks, the complex culture medium with components of bovine origin, the samples handling errors by the operators, the use of inappropriate equipment, the parameters of operation (agitation, pH and conductivity) outside specification limits affecting purity due to the high percentage of contaminants from the host; as well as, the inadequate filtering medium together with an incorrect preparation of the redundant filtration system in a non-sterile product. The actions could modify the technology proposed by Biomedical Research Division that allowed the design of a new production process of a biopharmaceutical product for the treatment of chronic viral diseases(AU)

Usos de la levadura Pichia pastoris en la producción de proteínas recombinantes / Uses of Pichia pastoris yeast in the production of recombinant proteins

La levadura metilotrófica Pichia pastoris (clasificada actualmente como Komagataella phaffii) es una de las más importantes para la producción de proteínas heterólogas. En el trabajo se presenta un análisis de las principales características que se ponen de manifiesto en la expresión de proteínas recombinantes expresadas en este microorganismo. Se describen las cepas disponibles para la transformación y producción de proteínas recombinantes expresadas en Pichia pastoris, los principales vectores comerciales para la expresión, los promotores más eficientes, los marcadores seleccionables, la señal de secreción, los métodos usados en las transformaciones genéticas y los patrones de glicosilación que se presentan. Se brindan recomendaciones generales acerca de los parámetros de bioprocesos como la composición del medio, el pH, la temperatura, la velocidad de aireación, la inducción y las estrategias de alimentación para alcanzar altos valores de productividad. Se presentan los resultados de las aplicaciones de Pichia pastoris en la producción de dos vacunas en Cuba, la vacuna contra la hepatitis B y la vacuna para el control de la garrapata(AU)

Pichia pastoris metylotrofic yeast (currently classified as Komagataella phaffii) is one of the most important yeast for the production of heterologous proteins. The work presents an analysis of the main characteristics that are marked in the production of recombinant proteins expressed in Pichia pastoris. It describes the strains available for the transformation and production of recombinant proteins expressed in P. pastoris, the main commercial vectors for expression, the most efficient promoters, selectable markers, the secretion signal, the methods used in genetic transformations and glycosylation patterns that occur. General recommendations are provided on bioprocess parameters such as media composition, pH, temperature, aeration velocity, induction, and feeding strategies to achieve high productivity values. The results of Pichia pastoris applications for the production of two vaccines in Cuba, the hepatitis B vaccine and the tick control vaccine are shown(AU)

Empleo de células madre mononucleares en el tratamiento de osteoartritis en rodilla: caso de estudio en Cuba / Using Mononuclear Stem Cells for Osteoarthritis-Knee Treatments: A Case Study in Cuba / Uso de células-tronco mononucleares no tratamento da osteoartrite de joelho: estudo de caso em Cuba

Resumen Introducción: el desarrollo alcanzado en la medicina regenerativa posibilita el tratamiento de enfer medades incurables o que tienen una respuesta reducida a las terapéuticas actuales, así como la dis minución del consumo de medicamentos, en algunos casos. En Cuba, las especialidades de angiología y de ortopedia y traumatología son las que más han aplicado esta terapia. En el artículo se interpretan estadísticamente los resultados de la comparación, mediante STATGRAPHICS® Centurion XVI, de las varia bles controladas en dos tratamientos de osteoartritis en rodilla, uno empleando células madre mononucleares obtenidas de la sangre periférica y otro con la terapia convencional, para fundamentar la superioridad del nuevo tratamiento. Presentación del caso: se trataron 100 pacientes adultos atendidos en el Departamento de Ortopedia del Instituto de Hematología e Inmunología por osteoartrosis de rodilla, divididos en dos grupos. El grupo A (control) recibió el tratamiento convencional de infiltración con acetato de triamcinolona en la articulación afectada. El grupo B (estudio) recibió la implantación del concentrado de células mononucleares adultas hematopoyéticas por vía percutánea. Conclusión: se analizaron cada una de sus variables y se pudo comprobar que la mayoría de los datos recopilados no cumplía con una distribución normal, por lo que las siguientes pruebas se ejecutaron tomando como referencia la mediana de cada muestra. Se comparó entre la evaluación del dolor a la actividad y el consumo de medicamentos de cada uno de los grupos de tratamiento. Se evidenció la mejor respuesta de los pacientes para el tratamiento con células madre y una disminución en el consumo de fármacos.

Abstract Introduction: The development achieved in regenerative medicine has allowed the treatment of incurable diseases or those with a reduced response to current therapies, as well as cases with decreased consump tion of medicines. In Cuba, angiology, orthopedic, and traumatology specialists use this therapy the most. In this paper, we have presented the statistical analysis using the STATGRAPHICS® Centurion XVI for controlled variables in two osteoarthritis-knee treatments, one using mononuclear stem cells obtained from the peripheral blood and the other with a conventional therapy so as to demonstrate the superiority of the new treatment regime. Case report: A total of 100 adult patients treated in the Orthopedic Department at the Hematology and Immunology Institute for osteoarthritis-knee pains were studied. Group A (control) received the conventional treatment with triamcinolone acetate infiltration in the affected knee. Group B received the percutaneous implantation of the hematopoietic adult mononuclear cell concentrate. Conclusion: The analysis of each of the variables was performed to verify that most of the collected data did not comply with a normal distribution; hence, the following tests were performed taking the median of each sample as a reference. Comparisons were made between the evaluation of pain to the activity, as well as the consumption of drugs from each of the treatment groups. The best response of the patients was indicated for treatments with stem cells and a decrease in the consumption of drugs.

Resumo Introdução: o desenvolvimento alcançado na medicina regenerativa possibilita o tratamento de doenças incuráveis ou que têm uma resposta reduzida frente às terapias atuais, bem como a redução do consumo de medicamentos, em alguns casos. Em Cuba, as especialidades de angiologia e ortopedia e traumato logia são as que mais têm aplicado esta terapia. O estudo interpreta estatisticamente os resultados da comparação, por meio do STATGRAPHICS® Centurion XVI, das variáveis controladas em dois tratamentos de osteoartrite de joelho, sendo um utilizando células-tronco mononucleares obtidas de sangue periférico e outro com terapia convencional, com o objetivo de comprovar a superioridade do novo tratamento. Apresentação do caso: foram tratados 100 pacientes adultos atendidos no Departamento de Ortopedia do Instituto de Hematologia e Imunologia para osteoartrite de joelho, divididos em dois grupos. O grupo A (controle) recebeu tratamento convencional de infiltração com acetato de triancinolona na articulação afetada. O grupo B (estudo) recebeu implantação percutânea de concentrado de células mononucleares hematopoiéticas adultas. Conclusão: a análise de cada uma de suas variáveis foi realizada e constatou-se que a maioria dos dados coletados não obedecia a uma distribuição normal, de modo que os seguintes testes foram realizados tomando-se como referência a mediana de cada amostra. Foram feitas compara ções entre a avaliação da dor à atividade, bem como o consumo de medicamentos em cada um dos grupos de tratamento. Evidenciou-se uma melhor resposta dos pacientes ao tratamento com células-tronco e diminuição do consumo de medicamentos.

Modelo matemático para predecir la formación de agregados en el proceso de purificación de un anticuerpo monoclonal / Mathematical model for predicting the formation of aggregates in the purification process of a monoclonal antibody

El uso de anticuerpos monoclonales en la lucha contra el cáncer se convierte cada día más en la terapia de elección. Para la introducción de anticuerpos monoclonales en mercados internacionales de alta demanda y con elevados requerimientos de calidad se requiere su producción a gran escala. El incremento de la presencia de dímeros en el producto final afecta su calidad y, por tanto, la eficiencia y eficacia del proceso. El objetivo del presente trabajo fue obtener un modelo matemático que permita relacionar el porcentaje de dímeros con las variables de operación de mayor influencia. Se realizó el ajuste de un modelo de regresión lineal múltiple usando el programa Statgraphics Centurion XVII versión 17.2.00. El modelo se validó con lotes de producción, logrando errores relativos inferiores al 20 por ciento. Las variables significativas obtenidas fueron: masa de IgG en el sobrenadante; masa de IgG en el producto de salida del paso de captura de proteína A; pH en el producto de salida del paso de captura de proteína A; pH del producto ajustado y conductividad de salida en la membrana de intercambio aniónico. El modelo permitió encontrar un intervalo de trabajo de las variables de mayor influencia en la formación de dímeros para reducirlos hasta valores inferiores al 3 por ciento(AU)

The use of monoclonal antibodies in the fight against cancer is becoming more and more the selected therapy. The introduction of monoclonal antibodies highly demanded in international markets, with high quality requirements needs the production of monoclonal antibodies on a large scale. The increase of dimers in the final product affects its quality, therefore, the efficiency and effectiveness of the process. The objective of this work was to obtain a mathematical model to relate the percentage of dimers with the most influential operating variables. A multiple linear regression model was obtained using Statgraphics Centurion XVII version 17.2.00 software. The model was validated with new production data with a mean error of validation below 20 percent. The significant variables were: supernatant IgG mass; IgG mass in the effluent from Protein A capture column; pH of the effluent from Protein A capture column; pH of the adjusted product and conductivity of the effluent from anionic exchange membrane. A working interval for each of the influential variables were established, in order to reduce dimers below 3 percent(AU)

Mejora tecnológica del proceso de llenado aséptico para la producción de la vacuna Antihepatitis B recombinante / Improvement of the aseptic filling process for the production of recombinant hepatitis vaccine

Frente a la creciente demanda de producción de la vacuna Antihepatitis B recombinante, constituye un reto para el Centro Nacional de Biopreparados aumentar la fabricación del producto, para lo cual el proceso de llenado aséptico requirió de una inversión. En el trabajo se presenta la selección de la nueva máquina llenadora y se calculan los indicadores económicos asociados a la inversión, la que se recupera en el cuarto año con una ganancia de $2.655.300. Luego de la inversión se evaluó el desempeño de la nueva máquina y se comparó con los resultados anteriores a la inversión. Se compararon los valores de volumen dispensado por vial, velocidad de llenado, rendimiento operacional, principales defectos detectados en los lotes de llenado, tiempo promedio de llenado de un lote, costo de producción y comportamiento del monto resarcido al cliente por rechazos de producto. El volumen dispensado por vial resulta más exacto, reduciendo las pérdidas de producto. La velocidad de llenado aumenta 1,7 veces respecto a la máquina anterior. El rendimiento operacional aumenta en un 13,63 percent. Disminuyen los rechazos de producto en 40.897 viales, representando un ahorro de $24.538 ingresados en 73 lotes producidos. Se ahorra en energía eléctrica un total de $14.718 en un mes. El costo unitario del proceso de llenado disminuye en 0,0648 $/vial(AU)

National Center for Biopreparations must increase the production of the recombinant hepatitis B vaccine because of its growing demand. In order to fulfill this challenge, the aseptic filling process required an investment. This work, presents the selection of the new filling machine and the economic indicators that support the investment. Inversion cost is recovered in the fourth year with a profit equivalent to $2,655,300. After the investment, the performance of the new machine was compared with the previous one. Volume dispensed per vial, filling speed, operational performance, major defects detected in filling batches, average filling time for a batch, production cost and payments to customers due to rejected products were compared. The control of the volume dispensed per vial is more accurate, reducing product losses. The filling speed increases 1.7 times compared to the previous machine. Operational performance increases by 13.63 percent. Product rejections are reduced by 40,897 vials, saving $24,538 for the 73 batches. Electricity consumption diminished, saving $14,718 monthly. The unit cost of the filling process decreases by $0.0648/vial(AU)

Aplicación del análisis de componentes principales en la formación de dímeros durante la purificación de un anticuerpo monoclonal / Application of Principal Component Analysis on dimers formation during a monoclonal antibodys purification

El producto Nimotuzumab, altamente demandado para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, se produce en el Centro de Inmunología Molecular a partir del cultivo, fermentación y purificación en la línea NS0/H7. El uso de tecnologías adecuadas para la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales, de acuerdo con las buenas prácticas de manufactura y con costos de producción razonables, se convierte en una necesidad para introducir anticuerpos terapéuticos en mercados de alta demanda y con elevados requerimientos de calidad. El incremento en la presencia de dímeros en el producto final afecta su calidad, por ende, la eficiencia y eficacia del proceso. Se utilizaron las bases de datos del centro para realizar un análisis de componentes principales, empleando el programa The Unscrambler 10.4 y se determinaron como variables más influyentes en la variabilidad de los resultados: las conductividades del producto ajustado y de salida en la columna de proteína A y membrana SQ y la masa de IgG en sobrenadante y eluato de proteína. Se realizó un análisis de Pareto para determinar los parámetros críticos del proceso, resultando ser: el pH de los tampones de elución y ajuste, del producto ajustado, de la salida en proteína y membrana, la masa de IgG en eluato de proteína y sobrenadante, y la conductividad del producto ajustado(AU)

ABSTRACT Nimotuzumab is produced at the Center of Molecular Immunology (CIM). It is obtained from the culture, fermentation, and purification in the cell line NS0/H7. This product has a high demand both domestically and internationally for the treatment of head and neck cancer. The use of adequate technologies for the large-scale production of this product following good manufacturing practices and reasonable production costs becomes a necessity to introduce this therapeutic antibody in high demand markets with high-quality requirements. The increase in dimers in the final product will affect its quality, which in turn affects the efficiency and effectiveness of the process. Production databases were used to perform principal component analysis using The Unscrambler 10.4 software. The conductivity of the adjusted product, pH at the output product in the protein column and membrane, the mass of supernatant, and of the eluate are detected as the variables with a higher influence on aggregate formation. The Pareto analysis was carried out to determine the critical parameters of the process: pH of elution and adjust buffers, and adjusted products, pH at the exit of protein column and membrane, the mass of protein in the eluate, and in the supernatant, and the conductivity of the adjusted product(AU)